Aide à l'enseignement de
de la Biologie
Faculté
des Sciences
Formation
Continuée
Biologie
Résumé
de la communication de M. Vincent
Bours
Professeur
à la Faculté de Médecine de l'Ulg
directeur du Centre
de Génétique humaine,
CHU Liège
Thème: Les tests génétiques
Définition : analyse de l'ADN, de l'ARN, des chromosomes, des protéines ou de métabolites afin de détecter des maladies liées à des anomalies génétiques. Le diagnostic des maladies génétiques ne repose pas donc uniquement sur des analyses d'ADN
Applications: - anomalies chromosomiques, - maladies monogéniques héréditaires, - prédisposition génétiques aux pathologies courantes
Anomalies chromosomiques: Ces anomalies chromosomiques font référence à des anomalies de structure de chromosomes. Ces anomalies concernent donc des fragments de chromosomes détectables par les techniques de cytogénétique et concernent dès lors un grand nombre de gènes.
Lorsqu'on parle des anomalies des chromosomes on désignera :
1) les anomalies de nombre
2) les réarrangements chromosomiques
a) Anomalies du nombre de chromosomes
On peut observer chez certains organismes (mais pas chez les mammifères) des euploïdies aberrantes c'est-à-dire une augmentation du nombre de jeux complets de chromosomes. Par exemple, certains végétaux présentent des individus triploïdes qui ont donc non pas une paire de chaque autosome mais trois copies de chaque autosome. Ces végétaux triploïdes (ou tétraploïdes) sont parfois recherchés dans l'agriculture en raison de leur grande taille.
Plus fréquemment, on observe des aneuploïdies c'est-à-dire des anomalies de la répartition du nombre de chromosomes avec perte de l'euploïdie. On désignera deux types principaux d'aneuploïdie : les monosomies qui résultent de la perte d'un chromosome et les trisomies qui résultent de la présence d'un chromosome surnuméraire. Ces anomalies de nombre sont liées le plus souvent à un problème survenu lors de la première division méiotique. Au cours de cette division, il y a non-disjonction de deux chromosomes homologues ce qui veut dire que 2 chromosomes homologues montent vers le même pôle apical créant de ce fait une gamète présentant 2 chromosomes homologues et une autre gamète à laquelle il manque un chromosome.
En pathologie humaine, on n'observe pas de cas de monosomie autosomique. La perte d'un chromosome entier ou d'un grand fragment de chromosome est donc toujours létale et ne permet pas le développement de l'embryon. Les seules monosomies que l'on puisse observer concernent la perte d'un des deux chromosomes sexuels et donnent naissance à des individus ayant un caryotype de 45 chromosomes désigné 45, XO. Ces sujets, atteints de ce qu'on appelle le syndrome de Turner, ont donc un chromosome X unique et pas de chromosome Y.
Chez l'homme toujours, on peut observer certains cas de trisomies. Cependant, ces trisomies ne s'observent qu'avec certains chromosomes, en général des chromosomes de petite taille. Il faut donc à nouveau en conclure qu'une trisomie intéressant la plupart des autosomes est létale. La seule trisomie qui donne chez l'homme naissance à des individus vivants et viables est la trisomie 21. Cette trisomie 21 est fréquente puisqu'elle intéresse 0,15% des naissances. Elle s'accompagne d'une série d'anomalies physiques et d'un retard mental et est désignée médicalement sous le terme de syndrome de Down. Cette pathologie est liée à la non-disjonction des chromosomes 21 au cours de la méiose, le plus souvent chez la femme.
En dehors de la trisomie 21, on peut observer certains enfants qui naissent avec d'autres trisomies, notamment les trisomies du chromosome 13 ou du chromosome 18. Ces trisomies sont cependant associées à des malformations très sévères au niveau de nombreux organes et entraînent le décès des enfants soit in utero soit peu de temps après la naissance.
On observe également des anomalies de nombre du chromosome sexuel et plusieurs syndromes ont été décrits tels que le syndrome de Klinefelter (47, XXY) ou encore des individus porteurs d'une formule chromosomique 47, XYY ou 47, XXX. Les anomalies de nombre des chromosomes sexuels sont beaucoup moins sévères que les anomalies de nombre des autosomes. Ceci s'explique par l'inactivation des chromosomes X surnuméraires dans les cellules chez les femelles et par le petit nombre de gènes présents sur le chromosome Y. Les anomalies phénotypiques observées chez les sujets porteurs d'anomalies de nombre de chromosomes X sont dues aux gènes situés dans la région pseudo-autosomique de ces chromosomes.
On considère que l'ensemble des anomalies physiques observées suite aux anomalies de nombre des chromosomes sont liées à une perte de l'équilibre génique. Effectivement, suite à une trisomie ou à une monosomie, il apparaît un déséquilibre entre les nombres de copies de plusieurs gènes et ce déséquilibre serait responsable de troubles du développement chez ces enfants. Par exemple, dans la trisomie 21, les gènes du chromosome 21 sont présents en 3 copies et leur niveau d'expression sera donc supérieur créant ainsi un déséquilibre entre ces gènes et ceux présents sur les autres chromosomes (2 copies).
b) Les réarrangements chromosomiques
Outre les anomalies de nombre, on peut observer un certain nombre d'anomalies de structure des chromosomes. Ces anomalies peuvent être des inversions, des délétions, des duplications ou des translocations chromosomiques. Dans ces anomalies, un morceau de chromosome est soit perdu soit dupliqué soit s'est déplacé (inversion ou translocation sur un autre chromosome). Ces réarrangements chromosomiques sont acceptables pour la cellule pour autant que chaque fragment chromosomique garde un centromère, ce qui est indispensable à sa montée vers le pôle apical lors de la division mitotique et deux télomères indispensables à la réplication de l'ADN et à la stabilité du chromosome.
Détection des anomalies chromosomique : La CYTOGENETIQUE
Les techniques de cytogénétique ont pour but d'étudier les chromosomes dans leur structure voire d'identifier la position de certains gènes au niveau de ses chromosomes.
a) Les caryotypes
L'établissement d'un caryotype permet l'observation des chromosomes au microscope et donc d'observer la structure de l'ensemble des chromosomes. Ceux-ci sont isolés en métaphase de la division cellulaire. Les caryotypes ne permettent qu'une étude relativement grossière de ces chromosomes et ne détectent que des anomalies de grande taille au niveau moléculaire c'est-à-dire qui couvrent généralement plusieurs millions de paires de base.
Un caryotype peut être réalisé à partir de n'importe quel type cellulaire présentant des mitoses. Le plus souvent, ces caryotypes seront réalisés à partir de lymphocytes de sang circulant ou, dans le cadre du diagnostic prénatal, à partir de cellules fœtales (amniocytes ou cellules de trophoblaste). Un caryotype est également fréquemment réalisé pour l'étude génétique des cellules cancéreuses.
Techniquement, l'établissement d'un caryotype à partir de lymphocytes requiert la remise en culture et leur stimulation à l'aide d'un agent mitogène, le blocage des cellules en métaphase par l'ajout de colchicine, la lyse des cellules grâce à un choc hypotonique et enfin la fixation et la coloration des chromosomes.
Les techniques de coloration permettent d'identifier les différents chromosomes et sont appelées banding. Les principales techniques utilisées sont :
- le G banding : les chromosomes sont traités à la trypsine afin de dénaturer les protéines et ensuite colorés avec du giemsa. Cette coloration permet de mettre en évidence des bandes claires et foncées au niveau de chaque chromosome et la succession de ces bandes est caractéristique d'un chromosome et permet donc de le reconnaître.
- le Q banding est obtenu par coloration des chromosomes à la quinacrine, ce qui permet l'obtention de bandes fluorescentes sur ces chromosomes.
Lors de l'établissement d'un caryotype, les chromosomes sont classés en fonction de leur taille et en fonction des colorations obtenues par les techniques de G banding.
Nomenclature :
On distingue par la lettre "p" les bras courts du chromosome et par la lettre "q" les bras longs. Les bandes observées en banding sont numérotées à partir du centromère. De cette façon, on peut localiser la position d'une anomalie sur un chromosome par une annotation de type p22.3 ou q21 par exemple.
Annotation :
Le caryotype est annoté par le nombre total de chromosomes suivi de l'identité des chromosomes sexuels observés. Un caryotype normal sera donc annoté 46 XX ou 46 XY.
Un caryotype trisomique sera annoté 47 XY, +21 ou 47 XX, +21.
b) FISH
La FISH ou fluorescent in situ hybridization (hybridation fluorescente in situ) permet par les techniques d'hybridation d'associer une sonde fluorescente avec les chromosomes en métaphase ou avec l'ADN des noyaux en interphase. La sonde utilisée est bien entendu spécifique d'un gène ou d'une région chromosomique donnée. Ces sondes permettent de mettre en évidence des régions chromosomiques s'étalant sur plusieurs milliers à plusieurs dizaines de milliers de paires de base. La sensibilité de la technique ne permet pas de détecter des anomalies fines (modification d'une ou de quelques paires de base).
Essentiellement, la FISH permet de mettre en évidence des anomalies de nombre de chromosomes (trisomie,….) des délétions ou des anomalies chromosomiques qui sont trop petites pour être détectées par le caryotype ainsi que des modifications de structure d'un gène ou d'un fragment de chromosome comme une translocation chromosomique ou une duplication.
Maladies monogéniques héréditaires
Ces pathologies sont dues à l'anomalie d'un seul gène et sont transmises selon les lois de Mendel. Elles représentent donc toutes les maladies génétiques transmissibles "classiques": dominantes, récessives ou récessives liées à l'X.
Le diagnostic génétique se fait sur base de:
- suspicion clinique
- antécédents familiaux
- dépistage systématique pour des pathologies frééquentes (mucoviscidose) ou dont la prise en charge précoce améliore le pronostic (phénylcétonurie)
Le diagnotic génétique peut concerner:
- les sujets atteints
- les hétérozygotes porteurs
Chaque fois que cela est techniquement possible, les tests cliniques ou biochimiques seront confirmés par une mise en évidence directe de la mutation.
Exemples:
La mucoviscidose. Face à une suspicion de mucoviscidose, le médecin pédiatre mettra en route différents tests. Outre des altérations cliniques caractéristiques de la maladie, son diagnostic reposera sur des tests phénotypiques classiques tels que le test à la sueur. Ce test permet de doser l'ion-chlore dans la sueur et est positif lorsque le taux de chlore est accru. Cependant, un diagnostic de mucoviscidose sera toujours confirmé par un test génétique et par la recherche de mutations au niveau des gènes CFTR. Les difficultés de ce test résident dans le fait qu'il existe plusieurs centaines de mutations décrites au niveau du gène CFTR et qu'il est difficile de les rechercher toutes. L'analyse débutera dès lors par la recherche des mutations les plus fréquentes dans notre population. En cas de forte suspicion clinique, on poursuivra par la recherche de mutations plus rares. Enfin, en fonction de la clinique et des résultats des tests biologiques, si nécessaire, on pourra poursuivre par un séquençage complet de tous les exons du gène CFTR, mais cette dernière analyse est extrêmement longue et coûteusse.
La maladie de Duchenne. Le diagnostic de la maladie de Duchenne sera basé d'une part sur l'aspect clinique et d'autre part sur différents tests biologiques et histologiques en particulier sur la biopsie musculaire. Si possible, on complétera ces analyses par un test génétique avec détection de l'anomalie au niveau du gène de la dystrophine. Cependant, cette analyse génétique est particulièrement difficile à réaliser vu la très grande taille du gène et le fait que chaque famille présente sa mutation propre. Des études de délétion au niveau du gène de la dystrophine sont souvent réalisées par Southern blot ou par PCR. Il est cependant impossible pour des raisons techniques et économiques de réaliser un séquençage complet des 80 exons du gène de la dystrophine. Dès lors, dans certaines familles, on ne sait pas mettre en évidence le déficit génétique et le diagnostic de maladie de Duchenne se basera essentiellement sur les tests cliniques et histologiques. Les analyses génétiques seront limitées au suivi de la pathologie dans la famille par des études de liaison.
La drépanocytose. Dans cette situation, le test génétique est beaucoup plus facile à réaliser car la mutation est récurrente. Le test génétique est dès lors facile puisqu'il recherchera toujours la même anomalie ponctuelle.
Tests génétiques prédictifs
Définition : un test génétique prédictif est un test réalisé avant la survenue de la maladie et de ses symptômes. Ce test génétique va donc prédire la survenue d'une pathologie d'origine héréditaire.
Les tests génétiques prédictifs s'appliquent donc aux maladies héréditaires à déclaration tardive c'est-à-dire dont les symptômes ne sont pas apparents dès la naissance ou le jeune âge. En particulier, ces tests concernent des maladies neurologiques à déclaration tardive (maladie de Huntington et autres maladies neurologiques) ainsi que la prédisposition à certains cancers (cancer du colon et cancer du sein). Ces tests génétiques prédictifs doivent être manipulés avec beaucoup de prudence. On encouragera leur réalisation lorsque ceux-ci peuvent entraîner une prise en charge médicale préventive (mesures diététiques, médicamenteuses ou autres afin de prévenir la survenue de l'affection). Dans d'autres cas, si ces tests ne débouchent sur aucune prévention, l'intérêt médical de leur réalisation est beaucoup moindre et leur réalisation ne peut être proposée qu'avec énormément de précautions. Effectivement, ces tests génétiques prédictifs comportent un certain nombre de risques. Ces risques concernent d'une part l'impact psychologique de ces tests chez le sujet à qui on prédit la survenue prochaine d'une affection grave. D'autre part, ces tests peuvent avoir des répercussions sur la vie sociale et économique du sujet testé notamment en matière d'assurances et d'emploi.
La variation génétique
Les populations végétales, animales ou humaines ne sont pas homogènes génétiquement. Il existe donc une variabilité génétique entre les individus. Pour un seul gène il peut exister plusieurs allèles. Ce polyallélisme, également appelé polymorphisme, explique la variation génétique.
Le terme de polymorphisme désigne l'existence de plusieurs allèles (parfois nombreux) et pour chacun de ces allèles une fréquence élevée.
La notion de variation génétique et de polymorphisme a largement été confirmée et confortée par les données obtenues par le séquençage du génome humain. Ce séquençage a mis en évidence de très nombreux polymorphismes, c'est-à-dire que plusieurs formes existent pour la plupart des gènes humains.
A l'heure actuelle, un grand intérêt est porté aux polymorphismes intéressant les modifications de séquence au niveau d'un seul nucléotide : ceux-ci sont désignés par le terme de single nucleotid polymorphism ou SNP.
Au sein du génome humain, les polymorphismes sont très fréquents et au moins 1/3 des loci génétiques comporte deux allèles ou plus. En particulier, la fréquence des SNP est très élevée. Effectivement, d'après le séquençage du génome, on détecte un SNP toutes les mille paires de bases et au total plus d'un million de SNP ont été identifiés dans le cadre du séquençage du génome. Ces SNP sont probablement particulièrement importants s'ils se situent au niveau des régions codantes des gènes ou au niveau des régions régulatrices contrôlant l'expression des gènes. Ces SNP semblent responsables de la plus grande partie de la variation génétique entre individus.
Les conséquences fonctionnelles des polymorphismes par SNP seront variables en fonction de la position du SNP et de la répercussion de ces modifications de séquences nucléotidiques au niveau de la séquence d'acides aminés de la protéine.
Variations au sein d'une population et variations entre population
Lorsqu'on parle de variation génétique, on peut désigner les différences génétiques existant entre des individus au sein d'une même population étudiée ou encore des variations de fréquence allélique entre populations différentes. Chez l'homme, il est évident qu'un certain nombre d'allèles sont présents à des fréquences différentes selon les populations étudiées.
Néanmoins, lorsqu'on étudie les gènes présentant la plus grande variation génétique entre populations, on constate que ceux-ci conditionnent les caractères phénotypiques évidents, tels la couleur de la peau par exemple mais dont les répercussions fonctionnelles sont peu importantes. Par contre les gènes de structure qui conditionnent la fonction des protéines essentielles à notre organisme sont sujets à des modifications génétiques nettement moins importantes entre les différentes populations humaines.
Des études étendues ont été réalisées sur ce sujet pour constater que les différentes populations humaines se caractérisent par des fréquences assez semblables des allèles des gènes polymorphes. La plus grande proportion de la diversité génétique humaine est constatée entre des individus au sein même d'une même population. Comparativement, les différences génétiques entre des populations même éloignées l'une de l'autre sont très faibles. On conclut donc que la variation génétique entre individus au sein d'une population humaine est bien plus importante que la variation génétique moyenne existant entre les populations différentes. A partir de cette constatation, la notion de race dans l'espèce humaine est discutable (et discutée) puisqu'en dépit des apparences, les différences génétiques existant entre populations humaines sont très faibles.
Intérêt médical
Un grand nombre de caractères phénotypiques sont complexes et présentent une variation continue. C'est le cas notamment de paramètres tels que la taille, le poids la couleur des cheveux, la couleur de la peau, etc…. La plupart de ces caractères sont liés non pas à un seul mais à plusieurs gènes et sont également influencés par des facteurs environnementaux.
De très nombreux exemples peuvent être donnés qui témoignent de l'influence de l'environnement sur certains phénotypes dont le caractère génétique semble pourtant évident. Par exemple, on comprendra de manière assez évidente que la taille d'un individu, notamment dans l'espèce humaine, est conditionnée par des facteurs génétiques. Mais on sait également qu'en Europe, au cours des dernières décennies, la taille des hommes et des femmes s'est accrue progressivement. Cet accroissement rapide de la taille moyenne de la population ne peut être expliqué par des variations génétiques, celles-ci s'effectuant beaucoup plus lentement. De plus, on constate que l'accroissement de taille a été nettement plus marqué dans les classes sociales peu favorisées et est moins significatif dans les classes sociales plus favorisées. En d'autres termes, sans nier l'influence de la génétique sur la taille des individus, il est absolument évident que l'amélioration des conditions de vie (alimentation, soins médicaux, etc…) a influencé de façon très significative la taille moyenne des individus en Europe au cours du dernier siècle.
Les généticiens étudient les caractères héréditaires de susceptibilité à des maladies fréquentes dont les caractères de transmission génétique ne correspondent pas à un caractère mendélien. Ces pathologies sont souvent appelées maladies complexes et leur développement est influencé par l'interaction de gènes souvent multiples et de facteurs environnementaux. De nombreuses études ont démontré que certains polymorphismes génétiques (notamment des SNPs) étaient associés à une prédisposition accrue à la survenue de ces maladies. De telles études ont été réalisées sur un très grand nombre de maladies : maladies cardiovasculaires, maladies neurologiques (Parkinson, Alzheimer, ...), maladies psychiatriques (schizophrénie, dépression, ...), maladies inflammatoires (asthme, ...), cancers,….. A l'avenir, des tests génétiques « prédictifs » pourraient permettre d'étaablir des facteurs de prédisposition génétique à certaines pathologies dans le but de mettre en place des mesures de médecine préventive.
|
|
|
|
|